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紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法

点击次数:154 发布时间:2020/9/28
提 供 商: 来亨科技(北京)有限公司 资料大小:
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一、实验原理

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有吸收紫外线的性质,吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内,蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系,可用作定量测定。

利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是民迅速、简便、不消耗样品,低浓度盐类不干扰测定。因此,在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)得到广泛应用。此法的缺点是:(1)对于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质,有一定的误差;(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质,会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同,并利用这一性质,通过计算可以适当校正核酸的干扰作用。

二、实验用品

(一)器材

    (1) 752紫外分光光度计。

    (2) 移液管。

(3)试管及试管架。  

  (二)试剂

     标准蛋白质溶液:准确称量经微量凯氏定氮法校正标准蛋白质,用重蒸馏水配制成浓度为1mg/ml的溶液。

  (三)材料

         待测蛋白质样品溶液(用重蒸馏水适当稀释)。

三、实验程序

   1.标准法制作标准曲线

取8支试管,按表1-1分别向每支试管加入各种试剂,摇匀。

 

 

选用光程为1cm的石英比色杯,在280nm处分别测定各管溶液的OD280值。以蛋白质浓度为横坐标,OD280值为纵坐标,绘制标准曲线。

2.样品测定

 取适当浓度的待测蛋白质溶液,同样选用光程为1cm的石英比色杯,测定280nm处的光吸收值,并从标准曲线上查出待测定蛋白质的浓度。

 

 
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