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膜磷脂的实验原理

2020-06-08      109

实验原理

膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇,磷脂为含磷酸与氨碱的单脂衍生物,可分甘油磷脂及鞘氨醇磷脂两类,它们在生命活动中有重要作用。

用甲醇-Trichloromethane可将生物膜中的脂类组分提取出来。

1膜脂类的提取

  将冰冻干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0.8ml等渗的磷酸盐缓冲液中,加3ml Trichloromethane:甲醇,盖上试管塞,剧烈振荡最少1min,另外,再加1mlTrichloromethane振荡1min,最后加1ml水振荡1min。用台式离心机低速离心5min,在离心管里分相,缓缓地吸去上相,用细头滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层,吸出下相液,转移到一个已知重量的小烧杯内,置真空干燥器内,用水泵抽气,使溶液蒸发至干。称重。记录脂类抽提物的重量。

2. 磷脂的分析

1、硅胶板的规格及制作方法:准备几块15cm×15cm的玻璃板,洗净。烘干或滴上几滴乙醇,用清洁的纱布擦干。

   

   取3g硅胶H-碱式碳酸镁混合物或硅胶H-碱性硅酸镁混合物,置于水平台面上,使其自然干燥,然后放在110烘箱内活化30min,贮于真空干燥器内备用。

2、点样:用200µLTrichloromethane-甲醇溶解2mg干燥的脂类。取100µL溶解的样品溶液,点在距板的边缘约2cm处薄层板的一个角上,点样的面积要小,待样品干燥后再点一次,如此重复。

另取一块薄层板 ,依同样位置点上磷脂的标准样品混合液。

3、展层:采用倾斜上行法展层。展层缸内新配制的溶剂系统平衡,进行双相层析。

每相展层约需2h,当溶剂前沿距板的顶端2~3cm时,取出薄层板,用铅笔画出溶剂前沿位置,干燥。一相展层后,取出,在空气中干燥约15min,若空气湿度太大时,则须在放有硫酸干燥哭喊内干燥0.5h。

4、显色及定位:将干燥后的薄层板放入碘缸内,盖好。升华的碘与磷脂发生加成反应,而使磷脂的斑点呈现黄色或棕色。

斑点显现后,参考磷脂标准样品的相对位置及Rf值鉴别红细胞膜中含有那几种磷脂。

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