膜磷脂的实验原理

实验原理

膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇，磷脂为含磷酸与氨碱的单脂衍生物，可分甘油磷脂及鞘氨醇磷脂两类，它们在生命活动中有重要作用。

用甲醇-Trichloromethane可将生物膜中的脂类组分提取出来。

1膜脂类的提取

  将冰冻干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0.8ml等渗的磷酸盐缓冲液中，加3ml Trichloromethane:甲醇，盖上试管塞，剧烈振荡少1min，另外，再加1mlTrichloromethane振荡1min,后加1ml水振荡1min。用台式离心机低速离心5min,在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细头滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液，转移到一个已知重量的小烧杯内，置真空干燥器内，用水泵抽气，使溶液蒸发至干。称重。记录脂类抽提物的重量。

2. 磷脂的分析

1、硅胶板的规格及制作方法：准备几块15cm×15cm的玻璃板，洗净。烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。

   取3g硅胶H-碱式碳酸镁混合物或硅胶H-碱性硅酸镁混合物，置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110℃烘箱内活化30min,贮于真空干燥器内备用。

2、点样：用200µLTrichloromethane-甲醇溶解2mg干燥的脂类。取100µL溶解的样品溶液，点在距板的边缘约2cm处薄层板的一个角上，点样的面积要小，待样品干燥后再点一次，如此重复。

另取一块薄层板 ，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液。

3、展层：采用倾斜上行法展层。展层缸内新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析。

每相展层约需2h，当溶剂前沿距板的顶端2~3cm时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前沿位置，干燥。一相展层后，取出，在空气中干燥约15min，若空气湿度太大时，则须在放有硫酸干燥哭喊内干燥0.5h。

4、显色及定位：将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘与磷脂发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕色。

斑点显现后，参考磷脂标准样品的相对位置及Rf值鉴别红细胞膜中含有那几种磷脂。