微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量

微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量

一、实验原理

 天然有机物（如蛋白质和氨基酸等化合物）的总氮量通常用微量凯氏定氮法（micro-kjeldahl method）来测定。

当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为消化。由于消化过程进行缓慢，实验中常添加硫酸钾和硫酸铜的混合物来促进，硫酸铜是催化剂，硫酸钾可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使碳酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定。

 上述过程的化学反应如下：

        在微量凯氏定氮法中，常用硼酸-指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无机酸的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数，本法适用范围约为0.2~1mg氨。

       因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。

二、实验用品

（一）器材

 （1）微量凯氏定氮仪。

 （2）50ml凯氏烧瓶，100ml锥型瓶，50ml酸式滴定管，100ml量筒，100ml容量瓶，

      100ml烧杯，酒精灯。

（二）试剂

   （1）无水Diethyl Ether（AR）

   （2）粉末硫酸钾-硫酸铜混合物：K₂SO₄:CuSO₄.5H₂O=3:1、6：1或10：1。

   （3）40%（W/V）NaOH溶液。

   （4）4%（W/V）硼酸溶液。

   （5）0.01mol/L标准盐酸（用硼砂标定）：吸取分析纯HCL（比重1.19，约12mol/L）8.5ml，用蒸馏水稀释至1L，贮于试剂瓶中待标定。准确称取3份干燥的硼砂，每份0.381~0.383g分别放在150ml三角瓶中，加入20ml蒸馏水使其溶解，加入3滴甲基红指示剂（0.1g甲基红溶于250ml水中），用待测的盐酸滴定至橙红色为止，记下盐酸的滴定体积，通过计算即可知道盐酸的准确浓度：

（三）、材料

     豆浆（市售）。

• 实验程序

  （一）操作方法

   1.样品的消化

     在凯氏烧瓶中加入催化剂约50mg,用移液管依次加入3mL均一的豆浆和3ml浓硫酸（移液管要接近凯氏烧瓶底部，不使样品粘附在瓶口或瓶颈）。另取一支凯氏烧瓶加入3ml水代替豆浆，其余试剂同上，此为空白。

   将凯氏烧瓶放在通风柜内的电炉上加热，火力不要太猛，应以使液体保持微沸状态为宜。瓶内液体逐渐由黄色变为黑色，继而转为淡黄色，zui后成清澈蓝色溶液，消化即告*，取出烧瓶，冷却，将瓶内液体转移至50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。

 2.仪器的装置和蒸洗

   按图9-1装好凯氏定氮仪，再用蒸气进行蒸洗，以除去NH３和其他干扰物质。蒸洗方法如下：　　　　　　　　　　

　 接通冷凝水，打开夹子（J） ，往蒸馏瓶（B）内加入占球部1/3体积的清水，而后取5ml蒸馏水从小漏斗（A）缓慢地注入反应瓶（F），关上夹子（I），同时加热蒸馏瓶（B），蒸馏反应瓶内的蒸馏水，使其沸腾产生蒸汽。产生的气体沿导管上升到冷凝管（C），气体经过冷却从冷凝管末端（G）流入收集瓶。排出反应瓶（F）中的液休，重复蒸洗2~3次，以便较熟练掌握蒸洗的方法。反应瓶（F）中的液体排出的方法：样品蒸馏完毕后，继续加热使其沸腾，移开酒精灯，关上夹子（I），稍等片刻，由于蒸馏瓶（B）中的蒸汽较反应瓶（F）中的多，所以冷却后蒸馏瓶（B）中的压力比反应瓶（F）的低，反应瓶（F）内的废液迅速地从出样口（H）抽出到反应瓶外，随即自加样小漏斗（A）往反应瓶（F）中较快地倒入一子（K）排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子（I），稍等片刻，反应瓶（F）内的液体又迅速地从出样口（H）抽出，然后打开夹子（K）排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子（K），打开夹子（J），往蒸馏瓶（B）中加入1/3球部体积的清水，即可进行下一次蒸馏。仪器的安装和蒸洗过程中，应很好地掌握几个夹子的开关关系，避免漏气是实验成败的关键。

3.标准硫酸铵的测定

  (1) 吸取10 mL 4%硼酸溶液注入三角烧瓶，加人2滴指示剂，将其倾斜地放在冷凝管末端（G）下，使管末端插人溶液内。

 (2) 用移液管准确吸取5ml标准硫酸铵溶液置于小漏斗（A)，小心打开夹子（I），使其缓慢注入反应瓶(H)，用1?2 mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶(H)。

 (3) 量取5 ml 40% NaOH溶液，置小漏斗(A)，小心打开夹子（I），使其缓慢注入反应瓶(H)，同样用1?2 mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶(H)，关上夹子(I)，避免蒸馏过程氨散失。

 (4) 加热蒸馏瓶(B)使反应瓶内液体开始沸腾，立即收集氨，当三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色开始记时，蒸馏5 min后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1 cm,继续收集2~3min，zui后用蒸馏水把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中，即算蒸馏完毕。排出废液，量取5 ml蒸馏水蒸洗反应瓶一次，就可以进行第二份标准硫酸铵溶液的蒸馏工作。

 (5)将收集的各瓶蒸馏液分别用0.01 mol/L标准盐酸溶液滴定至蓝色消失，使溶液呈淡桔色为止。 

   用标准硫酸铵溶液连续测定3次,3次测定的终点颜色应一致， 滴定数据差值不超过±0.05ml.

 4. 样品及空白的测定 

 将3.1操作所得的消化液在定氮仪上进行含氮量测定,方法与标准硫酸铵溶液测定相同，并进行空白测定。

5.结果处理